دترجنت ها
دترجنت ها مولکولهای آمفیپاتیک (Amphipathic) هستند . یعنی در ساختا خود هم گروه آب گریز و هم گروه قطبی دارند . این مولکولها دارای گروه قطبی در انتهای یک زنجیره کربنی طویل و آبگریز هستند . به همین دلیل مولکولهای آمفیپاتیک در آب رفتار منحصر به فردی از خود نشان می دهند . گروههای قطبی آنها با مولکولهای آب پیوند هیدروژنی تشکیل می دهند . در حالیکه زنجیره های هیدروکربنی آنها ، با ایجاد بر هم کنشهای آب گریز ، به یکدیگر اتصال می یابند . این ساختار خاص به میسل (Miccelle) موسوم است . دترجنتها به دلیل همین خاصیت آمفیپاتیک خود قادرند ترکیبات هیدروفوب را در آب حل کنند .
در بافر محلول سازی ، دترجنت ها تقویت کننده اثر معرفهای کائوتروپیک هستند . این مواد در ممانعت از ایجاد بر هم کنشهای آب گریز بین گروههای داخلی ، که بر اثر عملکرد معرف های کائوتروپیک در معرض محیط خارجی قرار گرفته اند ، نقش مؤثری در محلول سازی ایفا می کنند . عدم محافظت از این گروههای آب گریز خطر از دست دادن پروتئین ها را به دلیل توده شدن در بر دارد . این مسئله به خصوص در مورد پروتئین های هیدروفوبیک ، نظیر پروتئین های غشائی ، که دارای چندین گروه آی گریز هستند ، بارزتر است .
دترجنتها در محلول ساختن پروتئین های غشائی مانند محیط 2 لایه لیپیدی غشاهای بیولوژیک عمل می کنند . این مواد از قسمت آب گریز خود داخل 2 لایه لیپیدی شده با گروههای آب گریز ایجاد پیوند می کنند . همین امر پخش شدن این گروهها را در محیط آبی از طریق تشکیل میسلهای دترجنتی امکان پذیر می کند .
دترجنت ها بر اساس ماهیت سر قطبی خود به دترجنت های یونی و غیر یونی و دو یونی طبقه بندی می شوند . از این میان فقط دترجنتهایی غیر یونی یا دو یونی اجازه مهاجرت پروتئین ها را در ایزوالکتروفوکوسینگ می دهد . دترجنتهایی مثل SDS با IEF سازگاری ندارند .
از دترجنتهای غیر یونی که در الکتروفورز دو بعدی استفاده می شوند ، NP40 و Triton X-100 در غلظتهای 4 – 0.4% رایجترین ها هستند . دترجنتهای دو یونی از دسته سولفوبتائین ها (Sulfobetaines) نسبت به دترجنتهای غیر یونی ارجحیت دارند . سولفوبتائین ها اولین انتخاب برای انجام IEF هستند و در غلظت های بین 2 – 4% مورد استفاده قرار می گیرند . از سولفوبتائین ها CHAPS و CHAPSO و از مشتقات سولفوبتائین های خطی نظیر SB3-10 و آمیدوسولفوبتائین ASB-14 هستند . برای محلول سازی پروتئین های غشائی گاهی مواقع Triton X-100 به مقدار کم ، 0.5% به یک دترجنت سولفوبتائین اضافه می شود . البته برخی از پروتئین ها برای حل شدن به غلظت بالای 4% از دترجنت ها نیازمندند .
به هر حال SDS رایج ترین دترجنت مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها است . خصوصیات شگفت انگیز SDS در محلول سازی پروتئین ها ناشی از تمایل شدید آن در پیوند با پروتئین هاست ، به طوریکه تقریبا یک مولکول SDS به هر دو اسید آمینه موجود در مولکول پروتئین اتصال می یابد . به این ترتیب به خاطر سر آنیونی SDS ترکیب پروتئین و SDS بیشترین حلالیت در آب را خواهد داشت . از دیگر مزایای استفاده از آن جلوگیری از تشکیل اولیگومرها است . گاهی اوقات اورگانیسم هایی با دیواره سلولی محکم ، قبل از اینکه در بافر محلول سازی لیز شوند ، به مدت 5 دقیقه در SDS 1-2% جوشانده می شوند . در استخراج بسیاری از پروتئین های هیدروفوبیک نیز به درصد بالایی از SDS نیاز است . به هر حال قبل از الکتروفورز ، SDS باید با جایگزینی رقیب در بافر محلول سازی از آن خارج شود . برای این کار در ابتدا نمونه حل شده در SDS با بافر محلول سازی رقیق می شود تا جایگزینی دترجنت های رقیب با SDS صورت پذیرد . برای خارج ساختن SDS ممکن است بعد از محلول سازی ، پروتئین ها توسط روش TCA-Acetone رسوب داده شوند . در صورت استفاده از این روش ممکن است رسوب حاصل مجددا به راحتی قابل حل شدن نباشد . اضافه کردن حجم کمی از سود 0.1 مولار می تواند برای غلبه بر این مشکل بسیار کارامد باشد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
|
روز بخير كاربر مهمان! 
