در روند تخلیص ، خلوص ، مقدار ، حفظ اکتیویتی پروتئین و اقتصادی بودن شرایط مالی و زمانی بسیار مهم است . خلوص مورد نیاز باید از بررسی نوع منابع مادی ، تعیین نوع استفاده از فراورده نهایی ، و ایمنی آن تعیین شود . برای مثال اختلاف بین آلودگی هایی که باید از نمونه برداشته شود و آلودگی هایی که می تواند در آن باقی بماند ، مهم است . فاکتورهای دیگری هم هستند که تأثیر گذارند . بازده بالا معمولا یک کلید مهم است . همچنین زمان پروسه با یک Assay آهسته ما را به کمترین بهره وری سوق می دهد . همه اطلاعات ما درباره خصوصیات پروتئین هدف و آلودگی های آن ، به ما در طی روند تخلیص کمک می کند و به ما اجازه می دهد ، سریعترین و راحت ترین تکنیک ها را انتخاب کرده و بهره وری بالایی داشته باشیم و از وضعیتی که ممکن است پروتئین هدف غیرفعال شود ، احتراز کنیم .
ایجاد یک تست Assay سریع و قابل اطمینان و تعیین فعالیت پروتئین ، برای ادامه پیشرفت در روند تخلیص ، ضروری است . ( بازده ، فعالیت بیولوژی ، بازیافت )
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 28 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت8:53 | |
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (عوامل احیاء کننده)
عوامل احیاء کننده
عوامل احیاء کننده گروه تیول برای شکستن پیوندهای دی سولفیدی داخل و بین مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند . معمولا این مرحله از اهمیت زیادی در محلول سازی برخوردار است . به خصوص برای پروتئین های منفک شده از سلولهای اوکاریوتی که نحوه تاخوردگی آنها بر پایه پیوند های دی سولفیدی استوار است .
مرکاپتواتانول در روشهای ابتدایی الکتروفورز 2 بعدی به کار گرفته می شد . اما به خاطر مشکلاتی که داشت امروزه از آن استفاده نمی شود . در واقع قسمتی از مرکاپتواتانول در PH بازی یونیزه می شود و داخل قسمت بازی ژل IEF می گردد و به خاطر قدرت بافر کنندگی موجب تخریب شیب PH در قسمت بازی می شود . اگر چه دی تیو تریتول (DTT) دارای pKa حدود 8 است ، اما به دلیل اینکه در غلظت بسیار کمتری استفاده می شود ، ( معمولا 50mM در مقایسه با 700mM موجود در 5% مرکاپتواتانول ) ، ایجاد مشکل مرکاپتواتانول را نمی کند .
دی تایوترایتول DTT و دی تایو اریتریتول DTE ، (Dithioerythritol) رایجترین عوامل احیا کننده مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها و IEF هستند . این معرف ها در یک واکنش تعادلی اکسیده شده و در عوض باعث احیاء پیوندهای دی سولفیدی می شوند . به همین دلیل معرفهای احیاء کننده در مقادیر اضافی ( حداکثر تا 100 میلی مولار ) مورد استفاده قرار می گیرند .
ساختمان شیمیایی DTE و DTT و واکنش آنها با پروتئین ها
به هر حال معرفهایی نظیر DTT و DTE کمی اسیدی و دارای بار الکتریکی هستند ، به همین دلیل در حین الکتروفوکوسینگ به سمت آند مهاجرت می کنند که این امر می تواند منجر به اکسیداسیون مجدد پروتئین های نمونه ، از دست دادن حلالیت نمونه در حین الکتروفورز و ایجاد رگه های افقی در قسمت بازی ژل شود . مخصوصا زمانی که از شیبهای IPG بازی بر روی بعد اول استفاده می شود . این پدیده مشهود تر است . این مسئله را می توان با قرار دادن یک کاغذ الکترود اضافی که در 20 میلی مولار DTT خیسانده شده است . بر روی کاتد حل کرد . بدین ترتیب جایگزینی DTT داخل ژل که به سمت آند حرکت می کند با DTT که این کاغذ در کاتد آزاد می گردد ، تضمین خواهد شد . روش دیگر برای اجتناب از وقوع این پدیده و حفظ قدرت تفکیک ، عدم انجام فوکوسینگ در زمانهای طولانی است .
فسفاین ها (Phsphines) می توانند جایگزین معرفهای احیاء کننده تیول باشند . معرف احیاء کننده بدون بار الکتریکی نظیر تری بوتیل فسفین Tributhyl phosphine , TBP در تمام طول IEF شرایط احیا را حفظ می کند . بدین ترتیب از ایجاد توده های پروتئینی ناشی از ایجاد مجدد پیوندهای دی سولفیدی ممانعت می نماید . علاوه بر این مزیت دیگر TBP امکان استفاده از آن در IEF با شیب های PH بازی است ، چرا که در این شیبها نیز شرایط احیا کنندگی را حفظ می نمایند . از خصوصیات دیگر فسفین ها عدم واکنش دهی شان با برخی از عوامل آلکیله کننده نظیر آکریل آمید و 4- وینیل پیریدین است . در زمان متعادل سازی می توان از این خاصیت برای طراحی یک مرحله ای احیا و آلکیلاسیون با TBP و آکریل آمید استفاده کرد . باید به این نکته توجه کرد که اسیدهای آیودو استیل و آمین ها با فسفینها واکنش می دهند و اگر در آلکیلاسیون از این مواد استفاده شود باید مراحل احیا و الکیلاسیون به صورت جداگانه صورت پذیرند .
فسفاین ها با زنجیره کوتاه مثل TBP در غلظتهای استوک ، موادی فرار ، سمی ، و به شدت قابل اشتعال هستند . اگر چه استوک های رقیق شده را می توان با امنیت مناسب مورد استفاده قرار داد ، اما مشکل در حمل و نقل استوکهای غلیظ است . در عین حال قیمت TBP در مقایسه با DTT بسیار بیشتر است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (دترجنت ها)
دترجنت ها
دترجنت ها مولکولهای آمفیپاتیک (Amphipathic) هستند . یعنی در ساختا خود هم گروه آب گریز و هم گروه قطبی دارند . این مولکولها دارای گروه قطبی در انتهای یک زنجیره کربنی طویل و آبگریز هستند . به همین دلیل مولکولهای آمفیپاتیک در آب رفتار منحصر به فردی از خود نشان می دهند . گروههای قطبی آنها با مولکولهای آب پیوند هیدروژنی تشکیل می دهند . در حالیکه زنجیره های هیدروکربنی آنها ، با ایجاد بر هم کنشهای آب گریز ، به یکدیگر اتصال می یابند . این ساختار خاص به میسل (Miccelle) موسوم است . دترجنتها به دلیل همین خاصیت آمفیپاتیک خود قادرند ترکیبات هیدروفوب را در آب حل کنند .
در بافر محلول سازی ، دترجنت ها تقویت کننده اثر معرفهای کائوتروپیک هستند . این مواد در ممانعت از ایجاد بر هم کنشهای آب گریز بین گروههای داخلی ، که بر اثر عملکرد معرف های کائوتروپیک در معرض محیط خارجی قرار گرفته اند ، نقش مؤثری در محلول سازی ایفا می کنند . عدم محافظت از این گروههای آب گریز خطر از دست دادن پروتئین ها را به دلیل توده شدن در بر دارد . این مسئله به خصوص در مورد پروتئین های هیدروفوبیک ، نظیر پروتئین های غشائی ، که دارای چندین گروه آی گریز هستند ، بارزتر است .
دترجنتها در محلول ساختن پروتئین های غشائی مانند محیط 2 لایه لیپیدی غشاهای بیولوژیک عمل می کنند . این مواد از قسمت آب گریز خود داخل 2 لایه لیپیدی شده با گروههای آب گریز ایجاد پیوند می کنند . همین امر پخش شدن این گروهها را در محیط آبی از طریق تشکیل میسلهای دترجنتی امکان پذیر می کند .
دترجنت ها بر اساس ماهیت سر قطبی خود به دترجنت های یونی و غیر یونی و دو یونی طبقه بندی می شوند . از این میان فقط دترجنتهایی غیر یونی یا دو یونی اجازه مهاجرت پروتئین ها را در ایزوالکتروفوکوسینگ می دهد . دترجنتهایی مثل SDS با IEF سازگاری ندارند .
از دترجنتهای غیر یونی که در الکتروفورز دو بعدی استفاده می شوند ، NP40 و Triton X-100 در غلظتهای 4 – 0.4% رایجترین ها هستند . دترجنتهای دو یونی از دسته سولفوبتائین ها (Sulfobetaines) نسبت به دترجنتهای غیر یونی ارجحیت دارند . سولفوبتائین ها اولین انتخاب برای انجام IEF هستند و در غلظت های بین 2 – 4% مورد استفاده قرار می گیرند . از سولفوبتائین ها CHAPS و CHAPSO و از مشتقات سولفوبتائین های خطی نظیر SB3-10 و آمیدوسولفوبتائین ASB-14 هستند . برای محلول سازی پروتئین های غشائی گاهی مواقع Triton X-100 به مقدار کم ، 0.5% به یک دترجنت سولفوبتائین اضافه می شود . البته برخی از پروتئین ها برای حل شدن به غلظت بالای 4% از دترجنت ها نیازمندند .
به هر حال SDS رایج ترین دترجنت مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها است . خصوصیات شگفت انگیز SDS در محلول سازی پروتئین ها ناشی از تمایل شدید آن در پیوند با پروتئین هاست ، به طوریکه تقریبا یک مولکول SDS به هر دو اسید آمینه موجود در مولکول پروتئین اتصال می یابد . به این ترتیب به خاطر سر آنیونی SDS ترکیب پروتئین و SDS بیشترین حلالیت در آب را خواهد داشت . از دیگر مزایای استفاده از آن جلوگیری از تشکیل اولیگومرها است . گاهی اوقات اورگانیسم هایی با دیواره سلولی محکم ، قبل از اینکه در بافر محلول سازی لیز شوند ، به مدت 5 دقیقه در SDS 1-2% جوشانده می شوند . در استخراج بسیاری از پروتئین های هیدروفوبیک نیز به درصد بالایی از SDS نیاز است . به هر حال قبل از الکتروفورز ، SDS باید با جایگزینی رقیب در بافر محلول سازی از آن خارج شود . برای این کار در ابتدا نمونه حل شده در SDS با بافر محلول سازی رقیق می شود تا جایگزینی دترجنت های رقیب با SDS صورت پذیرد . برای خارج ساختن SDS ممکن است بعد از محلول سازی ، پروتئین ها توسط روش TCA-Acetone رسوب داده شوند . در صورت استفاده از این روش ممکن است رسوب حاصل مجددا به راحتی قابل حل شدن نباشد . اضافه کردن حجم کمی از سود 0.1 مولار می تواند برای غلبه بر این مشکل بسیار کارامد باشد .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (معرفهای کائوتروپیک)
بافرهای محلول سازی
بافرهای محلول سازی ممکن است به تنهایی یا در ترکیب با روشهای دیگر متلاشی سازی سلولی به کار گرفته شوند . برای انجام جداسازی مناسب در بعد اول ، نمونه های پروتئینی باید کاملا غیر توده ای و به صورت محلول باشند . این امر برای تمامی انواع نمونه ها در هر مرحله ای از آماده سازی ضروری است . برای این منظور معمولا ، در ترکیب بافرهای محلول سازی از یک یا دو معرف کائوتروپیک ، دترجنت ، معرف احیا کننده ، و آمفولیت استفاده می شود .
در این قسمت به معرفی این اجزاء و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازی نمونه برای انجام الکتروفورز 2 بعدی می پردازیم .
معرفهای کائوتروپیک
بسیاری از پروتئین ها در اشکال طبیعی (Native) دارای چندین شکل فضایی مختلف هستند و به همین دلیل ممکن است در الکتروفورز 2 بعدی الگوهای پیچیده ای ایجاد کنند . این وضعیت تفسیر نمایه های 2 بعدی را دچار مشکل خواهد کرد . برای ساده تر کردن نمایه دو بعدی و حذف اثر شکل فضایی در ایجاد نقاط متعدد مربوط به یک پروتئین و ایجاد پیکی منفرد از آن ، بر هم زدن شکل طبیعی (Denaturing) توسط معرف ها کائوتروپیک انجام می شود .
اوره بهترین عامل کائوتروپیک در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دو بعدی است ، که معمولا با غلظت 8 مولار استفاده می شود . اوره از 2 طریق مستقیم و غیر مستقیم باعث بر هم زدن شکل طبیعی و باز شدن تا خوردگی (Unfolding) مولکولهای پروتئینی می شود . مولکولهای اوره مستقیما جذب گروههای آبدوست (Hydrophill) و قطبی در سطح پروتئین ها می شوند . این مولکولهای جذب شده به گروههای قطبی ، اثر دفعی بر یکدیگر دارند . برا اثر این نیروهای دفعی بر سطح ، مولکول پروتئین باز شده و متورم می گردد . همین امر گروههای آبگریز در سطوح داخلی پروتئین را در معرض محیط خارجی قرار می دهد . ورود آب و اوره به محیط داخلی پروتئین سبب ایجاد بی ثباتی و بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین می شود .
از طرف دیگر اوره از طریقی غیر مستقیم و با تغییر در ساختار و دینامیک آب می تواند در بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین مؤثر باشد . حضور این ماده باعث اختلال در شبکه پیوند هیدروژنی بین مولکولهای آب شده و ایجاد فضایی خالی در بین مولکولهای آب می نماید . این کاهش نا مطلوب در آنتروپی با فشار مولکولهای آب به مولکولهای آبگریز جبران می شود ، تا کمترین فضای ممکن را ایجاد نمایند . این پدیده به اثر آبگریزی (Hydrophobic Effect) موسوم است . اوره در غلظتهای بالا (6 الی 8 مولار ) ، نیروهای مؤثر در متراکم کردن ساختمان پروتئین ها به خصوص اثر آبگریزی را کاهش می دهد . به این ترتیب به طور غیر مستقیم ، قسمتهای مرکزی آب گریز در معرض و در دسترس عوامل محیطی قرار می گیرد .
زمانی که به شرایط کائوتروپیکی قوی نیاز باشد ، ترکیبی از تیواوره 2 مولار و اوره 5 الی 8 مولار مورد استفاده قرار می گیرد . تیواوره در مقایسه با اوره دناتوره کننده قوی تری است . اما نمی توان آن را به تنهایی مورد استفاده قرار داد ، چرا که حلالیت بسیار کمی در آب دارد . این ماده در محلول غلیظ اوره حلالیت بیشتری دارد . به همین دلیل مخلوط های اوره – تیواوره قدرت محلول کنندگی بهتری را از خود نشان می دهند . به علاوه این ترکیب قادر به جلوگیری از فعالیت آنزیمهای پروتئولیتیک نیز هست که در حضور اوره به تنهایی هم ممکن است فعال باقی بمانند .
درجه خلوص اوره بسیار مهم است و باید از حرارت دادن آن ، به دلیل تشکیل ایزوسیانات که از تجزیه اوره حاصل می شود ، خودداری کرد . ایزو سیانات باعث کربامیلاسیون پروتئین ها و تشکیل نقاط غیر واقعی در الگوی نهایی الکتروفورز 2 بعدی می شود . محلول حاوی اوره پایدار نیست و از ذوب و انجماد مکرر محلول حاوی اوره باید خودداری کرد . از طرفی دیگر ، اگر چه استفاده از تیواوره در نمونه باعث افزایش در بروز نقاط پروتئینی می شود ، اما ایجاد رگه های (Streaking) عمودی و نقاط مبهم و نامشخص در ناحیه اسیدی ژل را نیز سبب می شود که هنوز راه حل مناسبی جهت حذف این زواید پیدا نشده است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پیشرفت تکنیکها و روشها برای تخلیص پروتئینها ، برای پیشرفت بیوتکنولوژی ضروری است . این هند بوک که از اطلاعات و مثال های فراوانی تشکیل شده است ، برای هموار شدن مسیر تخلیص پروتئین ها تهیه شده است . گوناگونی مراحل تخلیص پروتئین از یک ته نشینی ساده تک مرحله ای ، تا یک پروسه معتبر لارج اسکل (Large Scale) ، می تواند باشد . اما اغلب ، بیشتر از یک مرحله برای رسیدن به خلوص مورد نظر ، برای تخلیص پروتئین ها مورد نیاز است .
کلید موفقیت و مؤثر بودن یک تخلیص ، در انتخاب کردن و برگزیدن از بیشترین تکنیکهای مناسب ، بالا بردن کارآیی توسط جور کردن ملزومات ، و آمیختن آنها در یک راه منطقی ، که مستلزم حداقل تعداد مراحل و حداکثر محصول است . در بیشتر طرحهای خالص سازی ، مبحث یکی از انواع کروماتوگرافی به میان می آید . چنانچه در هر آزمایشگاه تخلیص پروتئین ، ابزار کروماتوگرافی بسیار ضروری است . تکنیک های مختلف کروماتوگرافی با انتخاب پذیری های متفاوت ، می تواند ترکیب قدرتمندی را برای تخلیص هر بیومولکول ایجاد نماید . توسعه تکنیک های recombinant DNA انقلابی در تهیه پروتئین ها در مقیاس بالا می باشد . پروتئین های recombinant اغلب با روش راحت تری تولید می شوند ، اما بعد از تولید ، نوبت مرحله تخلیص به روش کروماتوگرافیست و این روش هنوز در همه تولیدات ، کاربردی است . گروههای آلوده کننده و مشکلات مربوط به انحلال آنها، ، حفظ ساختمان بی عیب و فعالیت بیولوژیکی مواردی است که باید ملاحظه شود .
اگر چه در آن ممکن است پارامتر های فراوانی ظاهر شود ، که باید ملاحظه شود ، اما با تعدادی راهنمایی ساده و همچنین به کارگیری سه مرحله در استراتژی تخلیص ، فرایند می تواند به صورت ساده و راحتی طراحی و انجام شود . این امر ممکن نیست مگر با دانستن اصول بنیادی و تفصیل تکنیکهای کروماتوگرافی .
ادامه مطلب مخصوص اعضاء
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در سه شنبه 18 دی 1389برچسب:تخلیص پروتئین ها,
در ساعت9:5 | |
پروتئومیکس و معالجه بیماری های صعب العلاج
آنالیز ، تخلیص و شناخت پروتئینها ، که هر کدام از آنها وظیفه ای خاص دارند ، باعث می شود ، بشر در آینده نزدیک کارهایی بتواند انجام دهد که نظیر نداشته باشد و تا به حال قادر به انجام آن نشده است . یکی از این کارها ، در زمینه پزشکی و ساخت دارو ها و معالجه بیماران صعب العلاج است . همانگونه که می دانیم بسیاری از بیماری ها به دلیل عدم سنتز یک ، یا چند نوع پروتئین است ، که خود این عدم سنتز می تواند علت های خاصی داشته باشد . هورمونها و آنزیم ها و مولکولهای مهمی ، که عدم وجود آنها ، مشکلات فراوانی را سبب می شود . پروتئومیکس در تشخیص این پروتئین ها کمک شایانی انجام می دهد . مثلا تشخیص پروتئین هایی که فقط در سلول های سرطانی تشکیل می شود ، و در سلولهای سالم دیده نمی شود . یا در تشخیص پروتین هایی که وجود و یا عدم وجود آنها ، در مغز یک انسان ، مشکلات خاصی مانند ms و عقب ماندگی های ذهنی و نظایر آنها ، ایجاد میکند . این رشته می تواند به پزشکان در ایجاد راهکارهایی برای درمان این نوع از بیماریها کمک کند . پزشکانی که روحیه تحقیق داشته باشند ، می توانند ایده های خوبی را دنبال کنند ، که فقط راه رسیدن به تحقق آنها ، پروتئومیکس و ژنومیکس است .
به عنوان مثال ، می توان سلول های مغز یک انسان عقب افتاده ذهنی را ، با سلول های مغز یک انسان سالم ، مقایسه کرد ( این بیماریها که اکثرا تا به حال ، لا علاج و ژنتیکی هستند ، بسیار جای کار دارند ) . این کار فقط با روش الکتروفورز 2 بعدی امکان پذیر است . اگر بیماری فرد ، به خاطر عدم سنتز یک یا چند نوع پروتئین باشد ، اگر بتوانیم این پروتئین ها را تهیه و تخلیص کنیم و یا به صورت مصنوعی ، یا روش های ژنومیکس سنتز کنیم و آنگاه ، به سلول برسانیم ، در حقیقت کلید حل این بیماری را یافته ایم و گام بزرگی را برداشته ایم .
نویسنده : ابوذر عسکری
9/10/1389
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در دو شنبه 9 دی 1389برچسب:پروتئومیکس,
در ساعت2:24 | |
بلاخره کار انتقال مطالب وبلاگ قبلی تمام شد
>>>بلاخره انتقال مطالب از وبلاگ قبلی
(proteomicsiran.blogspot.com)
به
(proteomicsiran.loxblog.ir)
به اتمام رسید<<<
به زودی با مطالب جدید مهمان شما دوستان خواهیم شد.
>>> کاربران عضو می توانند در این وبلاگ مطلب بگذارند <<<
( البته پس از بررسی مطلب ، توسط مدیر ، و به اسم کاربر عضو این کار انجام خواهد گرفت )
>>>ما علاقمند به تبادل لینک ، با تمام مدیرانی که وبلاگ یا وب سایت علمی دارند ، هستیم <<<
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
[+] نوشته
شده توسط ابوذر عسکری در 6 دی 1389برچسب:,
در ساعت15:35 | |
درباره وبلاگ
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)