تاریخچۀ الکتروفورز sds-page مطلب ارسالی از sara.Tavakoly

استفاده از این روش در تخمین وزن ملکولی پروتئین ها اولین بار توسط Shapiro و همکارانش در سال 1967 گزارش گردید و بعدها در 1969 محققینی به نام های Weber و Osborn این تجربه را تأیید کردند و سرانجام توسط Laemmli در 1970 به شکل امروزی ارائه گردید.امروزه استفاده از این تکنیک جهت تعیین وزن ملکولی پروتئین ها روش روتین و با اهمیت در آزمایشگاه های تححقیقاتی می باشد.این روش ضمن ساده بودن به میزان اندک نمونه جهت آزمایش نیاز دارد و دارای قدرت تکنیک مناسب جهت شناسایی و تعیین خلوص پروتئین هاست.

پروتئین های طبیعی دارای بار الکتریکی، وزن مولکولی و شکل فضایی متفاوتی هستند و این عوامل در حرکت الکتروفورتیکی پروتئین ها مؤثرند. Weber و Osborn نشان دادند که الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید در حضور دترجنت یونی سدیم دودوسیل سولفات یا لوریل سولفات یکی از کارامدترین روش ها برای تعیین وزن ملکولی پروتئین های نمونه می باشد.

sara.Tavakoly

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

[+] نوشته شده توسط در 25 اسفند 1389برچسب:لوریل سولفات,دودوسیل سولفات,بار الکتریکی,شکل فضایی,وزن مولکولی,الکتروفورز,SDS PAGE,

در ساعت 12:57 | |

تبریک به مناسبت فرارسیدن سال 1390

>>> این عید باستانی را پیشاپیش به شما عزیزان تبریک عرض می نمایم <<<

>>> امیدوارم همیشه سرافراز و سربلند باشید <<<

>>> و همیشه فرد تأثیر گذاری باشید <<<

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در چهار شنبه 29 اسفند 1389برچسب:,

در ساعت 12:14 | |

سنجش پروتئین ها (بخش دوم ، بیسین چونینیک ، برادفورد)

سنجش پروتئین ها (بخش دوم ، بیسین چونینیک ، برادفورد)

تعیین کمی پروتئین ها

· به طور کلی یک متد رضایت بخش و کامل برای تعیین غلظت هیچ نمونه پروتئینی وجود ندارد .

· انتخاب یک متد ، وابسته به نوع و ماهیت پروتئین ، ماهیت سایر ترکیبات نمونه پروتئینی ، سرعت مورد لزوم ، دقت و حساسیت تست است .

متدهای مورد استفاده برای تعیین پروتئینها

· Biuret Test بیوره

· لوری Folin-Ciocalteu ( Lowry ) Assay

· بیسین چونینیک Bicinchoninic Acid ( BCA ) Assay

· برادفورد Dye-Binding ( Bradford ) Assay

· اولترا ویولت Ultraviolet Absorbance

در ادامه مطلب مي خوانيد ،

تست بيسين چونينيك (BCA) ، تست برادفورد (Bradford)

. ادامه مطلب برای عموم آزاد است

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

ادامه مطلب

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در شنبه 21 اسفند 1389برچسب:بیسین چونینیک,برادفورد,اولترا ویولت,لوری,بیوره,سنجش پروتئین ها,کمپلکس لوري,کمپلکس بیوره,اندازه گیری غلظت پروتئین ها,تعیین پروتئین ها,

در ساعت 12:54 | |

سنجش پروتئین ها (بخش اول بیوره ، لوری)

سنجش پروتئین ها (بخش اول بیوره ، لوری)

تعیین کمی پروتئین ها

· به طور کلی یک متد رضایت بخش و کامل برای تعیین غلظت هیچ نمونه پروتئینی وجود ندارد .

متدهای مورد استفاده برای تعیین پروتئینها

· Biuret Test بیوره

· لوری Folin-Ciocalteu ( Lowry ) Assay

· بیسین چونینیک Bicinchoninic Acid ( BCA ) Assay

· برادفورد Dye-Binding ( Bradford ) Assay

· اولترا ویولت Ultraviolet Absorbance

تست بیوره (Biuret) کمپلکس بیوره

• Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.

• Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.

• Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940.

• Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269.

• Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.

ویژگیهای تست بیوره (Biuret)
· تکرار پذیر
· عوامل تداخل کننده بسیار زیاد (به عنوان مثال نمک آمونیوم )
· انحراف کم نسبت به متدهای لوری یا اولترا ویولت
· احتیاج به مقدار زیاد پروتئین (1-20mg)
· حساسیت کم

تست بیوره (Biuret)
1- 15 دقیقه قبل از استفاده ، اسپکتوفوتومتر را روشن شود.
2- نمونه ها با بافر رقیق شود . به صورت تقریبی 1-10mg/ml . به هر لوله تست 1ml نمونه اضافه شود . روش دوبلیکیت مورد لزوم است.
3- یک لوله حاوی 1ml بافر برای مرجع یا بلنک تهیه شود .
4- BSA با غلظت 10mg/ml تهیه کرده و استاندارهای 1 تا 10mg/ml از آن ساخته شود .
5- به هر لوله 9ml واکنشگر بیوره ریخته ، بلافاصله ورتکس شده ، اجازه دهید 20 دقیقه بماند .
6- در طول موج 550nm خوانده شود .

تست لوری (Lowry)

• Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951.

• Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978.

• Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).

• Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).

ویژگیهای تست لوری (Lowry)
· حساسیت در سرتاسر رنج آن
· قابل استفاده در دمای اتاق
· قابل استفاده در مقیاس میکرو پلیت
· 10-20 مرتبه حساستر از UV detection
· بسیاری از مواد در تست تداخل ایجاد می کنند . (اسیدهای قوی ، آمونیوم سولفات)
· زمان قابل توجهی را می طلبد
· این تست نسبت به نور حساس است ، لذا در طول انجام آن باید از نور دور باشد .
· میزان رنگ با پروتئین های مختلف ، تغییر می کند

تست لوری (Lowry)
1- نمونه ها که شامل 100 µg پروتئین است اضافه شود .
2- همه لوله ها با آب به حجم 1ml رسانده شود .
3- محلول تست آماده و معرف فولین رقیق شود .
4- در هر لوله 5ml معرف تست ریخته و کاملا ورتکس شود .
5- لوله ها به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبیت شود .
6- به هر لوله 0.5ml محلول رقیق شده فولین اضافه شود .
7- در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبیت شود .
8- لوله ها ورتکس شده .اسپکتوفوتومتر با بلنک صفر شده ، جذب آن را در 500-750nm خوانده شود .

Xin Li

Scott Group

05/10/2005

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در دو شنبه 9 اسفند 1389برچسب:بیسین چونینیک,برادفورد,اولترا ویولت,لوری,بیوره,سنجش پروتئین ها,کمپلکس لوري,کمپلکس بیوره,اندازه گیری غلظت پروتئین ها,تعیین پروتئین ها,

در ساعت 15:48 | |

تهیه ژل الکتروفورز به صورت گرادیانت

برای بررسی نمونه ای که دارای رنج وسیعی از جرم های مولکولی متفاوت است , باید از ژلی که دارای منافذی با اندازه های متفاوت است (شیب منافذ) , استفاده کرد . در این ژل منافذ در بالای ژل بزرگ تر از منافذ پایین ژل است . در حین پیشرفت کار حرکت پروتئین ها بیشتر محدود می شود . در حضور یک ژل گرادیانت رنج وسیعی از جداسازی حاصل می شود و نسبت به یک ژل با غلظت یکسان , باندها بهتر نگه داشته می شوند .

تهیه ژل گرادیانت :
ژلهای گرادیانت اگر چه از ژلهای با غلظت ثابت مشکل تر ریخته می شوند , اما رنج پهناوری از پروتئین ها را جدا سازی می کنند . بعلاوه اینکه محاسبه وزن مولکولی آنها خیلی ساده تر است , زیرا برخلاف ژلهایی که غلظت ثابت دارند , ارتباط بین Log اندازه مولکولها و میزان حرکت آنها در سرتاسر رنج جداسازی روی ژل , خطی است .

مواد و تجهیزات :
محلول ژل
ساکاروز (Sucrose)
گرادیانت میکر
پمپ پیریستالتیک با توانایی 1.6ml/min
لوله مخصوص پمپ
بهم زن مغناطیسی
یک دستگاه الکتروفورز , همراه صفحات شیشه ای و اسپیسرها و شانه مخصوص .
جایگاه ریختن ژل
منبع الکتریسیته

دستورالعمل :
1- جایگاه ریخته شدن ژل را نصب نمایید .
2- لوله پمپ را به محل اتصال خروجی گرادیانت میکر وصل کنید . سر دیگر آن را به پمپ متصل کنید . طول مدت ریخته گری ژل 5- 10min طول خواهد کشید . لوله دیگر را از پمپ به جایگاه ریخته شدن ژل وصل نمایید .
3- دو نوع محلول با غلظت های کم و زیاد را که در داخل مخزن های گرادیانت میکر ریخته خواهند شد , طبق جدول درست نمایید . این محلول ها دارای آمونیوم پرسولفات است ولی از ریختن TEMED در آنها خود داری نمایید . ژلهای 5-20% و یا 10-20% ژلهای مطلوبی هستند . هواگیری در این پروتوکل لازم نیست . محلول ها را میکس نمایید . محلول غلیظ تر را برای جلوگیری از پلیمریزاسیون در محیط یخ یا آب سرد قرار دهید . محلول غلیظ آکریل آمید ممکن است بدون حضور TEMED و فقط با آمونیوم پرسولفات اضافه شده , پلیمره شود .
4- TEMED را به آرامی به محلول درون مخزنها که در حال میکس شدن است , اضافه کنید . توجه کنید که اول محلول ژل را به گرادیانت میکر اضافه نمایید ( بدون اضافه کردن TEMED ) . فقط قبل از باز کردن شیر خروجی به ازای هر میلی لیتر 33 میکرو لیتر TEMED به محلول اضافه نمایید .
5- محلول غلیظ تر در مخزنی که میکسر دارد و خروجی آن به ژل متصل است , ریخته می شود . در هنگام پر کردن محفظه ژل , محلول غلیظ تر زود تر از همه وارد محفظه ژل می شود . وقتی که محلول غلیظ تر وارد محفظه ژل می شود , به ته آن می رود . محلول رقیق تر به مخزنی که همزن دارد , وارد می شود و بدین ترتیب محلول غلیظ کمی رقیق تر می شود .
6- شیر را باز کنید , تا این عمل انجام شود .سپس ببندید .
7- محلول رقیق وارد مخزن دارای میکسر می شود .
8- محلول در این مخزن میکس می شود .
9- شیر خروجی و پمپ را روشن کنید .
10-وقتی که شلنگ در حدود چند میلی لیتر از محلول غلیظ پر شد , شیر میان دو مخزن را باز کنید . پمپ تا زمانی که محفظه ژل پر شود , روشن باقی می ماند .
11-روی سطح ژل را با 0.3ml آب اشباع شده با n-butanol بپوشانید و صبر کنید تا پلیمریزاسیون انجام شود . سپس ژل بالا (stacking gel)را بریزید .

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در دو شنبه 9 اسفند 1389برچسب:n-butanol,TEMED,آمونیوم پرسولفات,ژل الکتروفورز,گرادیانت,

در ساعت 9:51 | |

راهنماي شماتيك استراتژي تخليص

AMERSHAM_ProteinPurificGuide

راهنماي شماتيك استراتژي تخليص

براي دانلود تصوير بالا ، با رزوليشن مناسب ( فارسي mb 1.8)

پسورد : proteomicsiran.loxblog.ir

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در یک شنبه 1 اسفند 1389برچسب:تخليص پروتئين,تكنيكهاي تخليص,استرات‍‍ژي تخليص,

در ساعت 13:24 | |

مناسبت استفاده از تكنيكهاي تخليص در هر 3 فاز استرات‍ژي تخليص

مناسبت استفاده از تكنيكهاي تخليص در هر 3 فاز استرات‍‍ژي تخليص

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در یک شنبه 1 اسفند 1389برچسب:تخليص پروتئين,تكنيكهاي تخليص,استرات‍‍ژي تخليص,

در ساعت 13:14 | |

طيف سنجي جرمي (Mass Spectroscopy)

طیف سنجی جرمی (Mass Spectroscopy)

طیف جرمی به صورت نموداری از درصد فراوانی یون بر حسب نسبت m/e نشان داده می شود . فراوان ترین یون تشکیل شده در محفظه یونیزاسیون بلندترین قله را در طیف جرمی تشکیل می دهد . این قله را قله مادر (Base Peak) می نامند .

جدا کردن یک الکترون از یک مولکول ، یونی را ایجاد می کند که وزن آن ، وزن مولکولی واقعی اولیه است . این یون ، یون مولکول (Molecular Ion) است .

طيف سنجي جرمي

مقدار m/e که در آن یون مولکول [M⁺] بر روی طیف ظاهر می شود ( با فرض اینکه آن یون فقط فاقد یک الکترون باشد ) دارای وزن مولکولی مولکول اولیه است . یون مولکول در واقع یک کاتیون- رادیکال است . بسیار از اوقات ایزوتوپها در یک یا دو واحد جرمی بیش از جرم اتم معمولی ظاهر می گردند . بنابر این علاوه بر کاوش قله یون مولکول[M⁺] ، تلاش می شود قلل [M⁺¹] ، [M⁺²] و ... نیز یافت شوند . گاهی از روی الگوی این ناحیه از طیف جرمی می توان ، نوع عناصری مانند هالوژنها و تعداد آنها را یافت .

یونهایی که طول عمر آنها بیش از 10^-6 ثانیه باشد ، قبل از اینکه فرصت جزء به جزء شدن بیابند ، در محفظه یونیزاسیون شتاب داده می شوند . در حین عبور از محفظه تجزیه گر طیف سنج جرمی این اجزاء خرد شده و قطعات یونی جدیدی تولید می کنند ، که انرژی آنها به مراتب کمتر از یونهای معمولی است . چون بخش بدون بار بخشی از انرژی را به همراه خود می رباید . قطعه یونی تشکیل شده دارای نسبت m/e خاصی است که بستگی به جرم جزء اولیه و جزء جدید تشکیل شده دارد . این یون را قله یون پایدارنما(Meta Stable Ion Peak) نشان می دهد . m/e این جزء یونی تشکیل شده معمولا عددی غیر صحیح است و جرم آن m^* از رابطه زیر به دست می آید .

m^*= m₂ / m₁

که m₁ = جرم یون اولیه و m₂ = جرم قطعه یونی جدید می باشد .

*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در یک شنبه 1 اسفند 1389برچسب:mass,Mass Spectroscopy,طيف سنجي جرمي,,

در ساعت 13:5 | |

درباره وبلاگ

پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)