هدف :

۱- تعین حجمی که پس از آن اولین پروتئین از ستون خارج می شود و همچنین حجمی که آخرین پروتئین از ستون خارج میشود .

۲- امتحان کردن درستی packing ستون .

کاربرد :

در کروماتوگرافی به روش ژل فیلتراسیون (غربالی) این روش کاربرد دارد .

مواد و تجهیزات :

۱- ستون ژل فیلتراسیون(غربالی)

۲- برومو فنول بلو 0.005 گرم

۳- دکستران بلو 0.05 گرم

۴- سرنگ cc 5

۵- فیلتر

۶- شیشه cc 5

۷- آب مقطر

۸- پیپت cc 2 یک عدد

۹- پیپتور

۱۰- بشر یا ارلن برای خروجی ستون

۱۱- پیپت cc 10 یک عدد

۱۲- ظرف و بافر جهت شستشوی ستون (با توجه به نمونه ای که بعدا کار می شود این بافر می تواند فرق کند )

۱۳- استوانه مدرج cc 250 ( با توجه به حجم ستون )

ملاحظات ایمنی :

برای جلوگیری از خطرات بیولوژیک , الرژیک و شیمیایی , پوشیدن روپوش و کفش و دستکش ضروری می باشد .

روش کار :

۱- 5 cc محلول رنگ حاوی ( دکستران بلو 1 درصد و برومو فنل بلو 0.1 درصد ) درست می کنیم .

۲- فیلتر را به سرنگ متصل می کنیم .

۳- محلول رنگ را فیلتر می کنیم .

۴- بافر روی سطح ژل داخل ستون را خالی می کنیم .

۵- یک الی دو cc از محلول رنگ را توسط پیپت cc 2 بر می داریم .

۶- به آرامی پیپت را درون ستون وارد می کنیم . طوری که نوک پیپت به نزدیک سطح ژل برسد .

۷- نوک پیپت را به جداره شیشه ستون می چسبانیم .

۸- به آرامی طوری که سطح ژل به هم نخورد , رنگ را خالی میکنیم و همزمان پیپت را دور تا دور شیشه ستون می چرخانیم ( نمونه گذاری ) .

۹- در زیر ستون یک ظرف ( ارلن یا بشر) قرار می دهیم .

۱۰- شیر خروجی ستون را باز می کنیم .

۱۱- زمانی که سطح رنگ به سطح ژل رسید , دوباره شیر خروجی را می بندیم .

۱۲- حال با یک پیپت تمیز حدود 1 الی 2 cc از بافر مورد نظر (بافرشستشو) را درست به همان طریق که رنگ را نمونه گذاری کرده اید , به ستون اضافه می کنید . ( هدف از این کار شستشوی شیشه داخلی ستون که آغشته به رنگ است , می باشد ).

۱۳- دوباره شیر خروجی ستون را باز می کنیم .

۱۴- زمانی که سطح بافر به سطح ژل رسید , دوباره شیر خروجی را می بندیم .

۱۵- مرحله 12 را دوباره تکرار می کنیم . اگر بافر روی سطح ژل الوده به رنگ نبود ,تا حدود 10 الی 15 سانتیمتر بالا تر از سطح ژل بافر اضافه می کنیم .

۱۶- ورودی ستون را به منبع بافر متصل می کنیم .

۱۷- شیر خروجی ستون را باز می کنیم . و می گذاریم که ستون کار کند .

۱۸- اولین قطره ای که از رنگ دکستران بلو( ابی رنگ ) خارج شد , شیر خروجی را می بندیم و حجم محلول داخل ظرف زیر ستون را توسط استوانه مدرج به دست می آوریم و یادداشت می نماییم .این حجم معرف حجم تهی ستون می باشد .

۱۹- ظرف خالی را زیر ستون گذاشته و شیر خروجی ستون را باز می کنیم و می گذاریم که ستون کار کند .

۲۰- آخرین قطره ای که از رنگ برومو فنل بلو( بنفش رنگ ) خارج شد , شیر خروجی را می بندیم و حجم محلول داخل ظرف زیر ستون را توسط استوانه مدرج به دست می آوریم و یادداشت مینماییم. این حجم بعلاوه حجم تهی , معرف حجم نهایی ستون می باشد .

۲۱- شیر خروجی ستون را باز می کنیم تا ستون کاملا شسته شود . هنگامی که ستون کاملا شسته شد , متوانیم شیر خروجی را ببندیم .

۲۲- با داشتن حجم تهی و حجم نهایی می توانیم که اولین نمونه پروتئین را بعدا نمونه گذاری کنیم .

۲۳- یک برچسب که مشخصات ستون روی آن ثبت شده است , روی ستون می چسبانیم . مشخصاتی همچمون نوع ژل , ارتفاع ستون , نام شخص , تاریخ پر کردن , حجم تهی , حجم نهایی .

نکته :

اگر در طی کار کردن ستون متوجه شدیم که رنگ از یک مسیر بیشتر جریان دارد ( شیار ادٌی) , یعنی اینکه ستون خوب pack نشده است و باید ستون دوباره pack شود .

گزارش :

۱- مشخصات ستون را به صورت برچسب روی ستون نصب می کنیم .

۲- گزارش تهیه ستون و حجمهای تهی و نهایی را در دفتر کارهای روزمره آزمایشگاه ثبت می کنیم .

نویسنده : ابوذر عسکری