روشهای رسوبدهی
در روشهای آماده سازی نمونه ، رسوب دادن پروتئین ها به عنوان یک مرحله اختیاری تلقی می گردد . این روش برای جدا کردن انتخابی پروتئین ها از مواد آلاینده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها ، دترجنت ها ، اسیدهای نوکلئیک ، و غیره به کار گرفته می شود . از این روش برای تغلیظ پروتئین های موجود در یک نمونه که در حالت عادی بسیار رقیق باشند ، نیز استفاده می شود .
باید توجه داشت که هیچ روش رسوب دهی به طور کامل کارامد نیست و برخی از پروتئین ها بعد از رسوب داده شدن ، مجددا محلول نمی شوند . به همین دلیل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی استفاده کردن از این روش را در دستور کار می توان قرار داد . در صورتیکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترین نمایه دو بعدی یک نمونه باشد ، باید از انجام رسوبدهی صرف نظر کرد .
جزء به جزء کردن نمونه(Fractionation)
پروتئین هایی که در بافتهای اوکاریوتی بیان می شوند ، از گوناگونی بسیاری برخوردار بوده ، و دارای محدوده دینامیک (محدوده غلظت پروتئین های داخل یک نمونه بین کمترین تا بیشترین غلظت(Range Dynamic) ) وسیعی هستند . برخی از مواقع در نمونه هایی این چنین ، به منظور کاهش پیچیدگی نمونه و افزایش تعداد پروتئین هایی که دارای نسخه پایین هستند ، نمونه جزء به جزء می شود . می توان از روشهای متفاوتی مانند جزء به جزء کردن اجزاء سلولی (Sub-Cellular Fractionation) ، الکتروفورز در فاز مایع ، کروماتوگرافی جذبی و رسوبدهی انتخابی بهره برد . استخراج پی در پی (Sequential Extraction) پروتئین ها از یک سلول یا بافت بر اساس حلالیت آنها در دسته ای از بافر ها که قدرت و خاصیت محلول سازی آنها به تدریج افزایش پیدا می کند ، روش دیگری از جزء به جزء کردن است .
زمانی که قسمتی از پروتئین های سلول یا بافت مورد نظر باشد ، می توان در حین آماده سازی ، نمونه را نیز جزء به جزء کرد . اگر پروتئین هایی از یک قسمت زیر سلولی خاص مورد نظر باشند ، برای مثال ریبوزوم ها ، می توان ارگانل مورد نظر را توسط سانتریفوژ کردن تمایزی در شیبهای سوکروز جدا نمود . اگر چه این روشها را می توان در سلولهای پستانداران که معمولا دارای جداره سلولی ضعیفی هستند ، نیز به کار برد ، اما دسترسی به اورگانل ها در میکرواورگانیسم های دیگر بسیار مشکل است ، زیرا یک روش لیز کردن برای شکستن کارامد دیواره سلولی مورد نیاز است که در عین حال نباید آنقدر خشن باشد که باعث از بین رفتن ارگانل و تخریب آن شود .
رسوبدهی انتخابی بعضی از کلاسهای پروتئینی توسط استن-TCA صورت می گیرد . دیگر روش ، روشهای عصاره گیری متوالی با بافرهایی که به تدریج قدرت محلول سازی آنها افزایش می یابد ، است . مثلا بافرهای مائی ، حلالهای آلی نظیر اتانول ، کلروفورم و اتانول و محلول های حاوی دترجنتهای مختلف . بالاخره روشهای جداسازی کروماتوگرافی ، الکتروفورز در فاز مائی نیز در جزء به جزء کردن نمونه ها بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی متفاوت پروتئینهای موجود در نمونه قابل انجام هستند . تصمیم در انتخاب هر یک از این روشها بستگی به ماهیت نمونه و هدف از کار با نمونه دارد .
روشهای جزء به جزء کردن ، ممکن است مزایای بسیاری در غنی سازی پروتئین ها داشته باشند ، اما اصلی ترین نکته منفی در استفاده از این روشها ، این است که بسیار زمانگیر و بسیار پیچیده اند . همچنین نمی توان در یک زمان چند نمونه را وارد این مرحله از کار نمود . اما مزیت اصلی آن ،تعیین جایگاه پروتئین ها از نظر ساختمانی در زیر ساختار سلولی و تعیین عملکرد آنها است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
نظرات شما عزیزان:
|
روز بخير كاربر مهمان! 
